Fundada originalmente sobre la base de donaciones, la Biblioteca Nacional incorporó en 1817 la antigua biblioteca de los jesuitas, que había pasado a formar parte de la Universidad de San Felipe tras la expulsión de la orden en 1767. Durante los años siguientes, su acervo bibliográfico se amplió a partir de dos fuentes. La primera fue la creación del Depósito Legal en 1820, que obligaba a todas las imprentas del país a dejar en ella una copia de todo libro que publicaran. Durante el gobierno de Ramón Freire, esta disposición se amplió al otorgarse a la Biblioteca Nacional la administración de todas las imprentas del Estado, y el posterior desarrollo de la empresa editora en el país -a mediados de la década de 1830-, amplió considerablemente su patrimonio bibliográfico.
La segunda fuente sobre la que se formaron las colecciones más importantes de la Biblioteca Nacional, fue la compra o donación de bibliotecas de destacados intelectuales del siglo XIX. La primera adquisición fue la biblioteca de Mariano Egaña, gran jurista y estadista de la época, la que fue adquirida en 1846. En 1861 se adquirió la biblioteca del historiador y político Benjamín Vicuña Mackenna, en 1874 la del naturalista Claudio Gay, en 1878 la de monseñor José Ignacio Víctor Eyzaguirre, a las que siguieron la de Andrés Bello, destacado intelectual y jurista, la del historiador Ramón Sotomayor Valdés y otras, que sumadas a los volúmenes de la antigua biblioteca del Gobierno y la de los Tribunales de Justicia fueron dando cuerpo a la biblioteca más importante del país.
A principios del siglo XX, la Biblioteca Nacional recibió el aporte de nuevas colecciones, entre ellas la que había reunido el historiador y bibliógrafo José Toribio Medina -una de las más valiosas que ha recibido la institución- y la del historiador Diego Barros Arana, a las que se sumaron durante las décadas siguientes, la de Enrique Matta Vial, la de Raúl Silva Castro -que se conserva actualmente en la sección Referencias Críticas- la de Guillermo Feliú Cruz y la de Antonio Doddis.
Ya en el siglo XXI, el último gran legado que recibió la Biblioteca Nacional fue el de la poetisa Gabriela Mistral en diciembre de 2007, el que se puede consultar de forma remota a través de su Sala Virtual Gabriela Mistral.